上海交通大学医学院附属仁济医院
李继强、陆伦根、窦爱霞、宗蕾、周锟、潘浩、陈婷、丁俊
材料与方法
雄性健康清洁级 SD 大鼠 62 只， 3 周龄，体重约 120 - 140g （购自中国科学院上海实验动物中心）；饲养于上海交通大学医学院实验动物饲养中心。所有大鼠首先予普通饲料预养一周并随机编号标记，之后随机抽出 24 只作为空白对照组，继续给予普通饲料， 12 周末从中随机抽出 12 只处死做血清生化和组织病理分析；其余大鼠则从第二周起给予高脂饮食，配方为 “88 ％标准普通饲料＋ 10 ％猪油＋ 2 ％胆固醇 ” （ 世界华人消化杂志 2002 ， 10 ： 392-396 ），饲料加工成固体颗粒（猪油、分析纯胆固醇购自上海化学试剂有限公司，标准普通饲料由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，高脂饲料加工及辐照由上海斯莱克实验动物有限责任公司完成）。高脂饮食组分别于 4 周末、 8 周末、 12 周末随机抽取 3 只、 3 只、 12 只大鼠处死观察血清生化指标和肝脏组织学变化，分析模型制备情况；余下的随机分为近红外光治疗组和实验对照组（模型 A 组 10 只：继续喂饲高脂饮食 , 同时给予一定刺激）。治疗组自 13 周始每天近红外光照射，仪器为 DSG- Ⅰ 型 生物信息红外光肝病治疗仪（ BILT 肝病治疗仪），由杭州大力神医疗器械有限公司提供。具体方法为将仪器及鼠架固定好，使红外光源距离鼠架底部 15cm ，并调节环境温度在 28 ℃ ， 固定大鼠呈卧位，将指套式换能器夹到鼠尾上采集 “ 脉搏 ” 信息，脉搏频率出现后，调节仪器连杆臂使照射部位位于大鼠腹部肝区，照射时间为 18~20 分钟，近红外光治疗 7 周。 治疗过程中 近红外光组死亡 1 只，解剖显示为颅底出血。 19 周末剩余动物均以过度麻醉法处死并留取肝脏和血清待检，其中 2 只大鼠血标本在离心过程中因试管破裂而丢失。所有大鼠及鼠笼随机编号，并按笼随机分组。所有动物自由进食和饮水，温度、湿度符合标准，明暗 12 小时循环。所有大鼠每周称一次体重，治疗期间每 3 天称一次体重。注意观察动物的精神状态、活动情况、皮毛光泽度、食量、大小便等情况。
取各大鼠部分肝组织用 10% 中性福尔马林固定，制成石蜡切片并分别予常规 HE 染色和 Masson 染色，在光镜下观察肝组织脂肪变、炎症、纤维化程度。依据中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组制定的非酒精性脂肪性肝病诊疗指南的病理诊断标准 : 肝脂肪变可分为 4 度（ F0-4 ）： F0 为 <5% 肝细胞脂肪变； F1 为 5% ～ 30% 肝细胞脂肪变； F2 为 30% ～ 50% 肝细胞脂肪变性； F3 为 50% ～ 75% 肝细胞脂肪变； F4 为 75% 以上肝细胞脂肪变。肝组织炎症程度可分为 4 级（ G0-3 ）： G0 为无炎症； G １为腺泡 3 带呈现少数气球样肝细胞，腺泡内散在个别点灶状坏死； G ２为腺泡 3 带明显气球样肝细胞，腺泡内点灶状坏死增多，门管区轻～中度炎症； G ３为腺泡 3 带广泛的气球样肝细胞，腺泡内点灶状坏死明显，门管区轻～中度炎症伴 / 或门管区周围炎症。肝纤维化可分为 4 期（ S0-4 ）： F0 为无纤维化； S １为增腺泡 3 带局灶性或广泛的窦周 / 细胞周纤维化； S ２为纤维化扩展到门管区，局灶性或广泛的门管区星芒状纤维化； S ３为纤维化扩展到门管区周围，局灶性或广泛的桥接纤维化； S ４为肝硬化。收集各大鼠血液后分离血清用拜尔全自动生化分析仪（型号 ADVIA1650 ）分别检测谷氨酰转肽酶（ GGT ）、 碱性磷酸酶（ ALP ）（试剂盒购自上海科华生物工程股份公司）、丙氨酸氨基转移酶（ ALT ）（试剂盒购自德国罗氏制药）、天门冬氨酸氨基转移酶（ AST ）（试剂盒购自上海北加生化试剂有限公司）、总蛋白（ TP ）（试剂盒购自科华东菱试剂有限公司）、三酯酰甘油（ TG ）、胆固醇（ TC ）、低密度脂蛋白（ LDL ）、高密度脂蛋白（ HDL ）（以上试剂盒均购自德赛诊断系统上海有限公司）等血生化指标。剩余大部分肝组织均分为 1cm 3 大小置液氮内保存。
统计学分析使用 SPSS11.0 统计软件，经方差齐性检验后，两组均数比较采用两独立样本 t 检验，两组和多组程度比较采用多样本秩和检验， P<0.05 为差异有显著性。
结 果
一、 12 周正常对照组和高脂饮食组血清生化指标的比较以及病理组织学变化
正常对照组和高脂饮食组 12 周大鼠体重、肝指数和血清生化指标检测结果见表 1 ，结果显示高脂饮食组大鼠的体重、肝指数、 ALT 、 AST 、 ALP 、 TP 、 TC 和 LDL 均较正常组明显增高 ( P ＜ 0.01) ，而 HDL 较正常对照组降低 ( P ＜ 0.01) 。 肝组织病理学检测显示正常对照组肝脏组织未见炎症和脂肪变，高脂饮食组大鼠肝脏组织学炎症和脂肪变明显，部分出现纤维化，非酒精性脂肪性肝炎模型制备成功，可满足下一步的实验要求，具体结果见表 2 。
表 1 12 周正常对照组和高脂饮食组血清生化指标的比较
正常对照组 |
高脂饮食组 |
P 值 |
|
| 例数 |
12 |
11 |
|
体重（ g ） |
588.75±53.63 |
674.83±78.49 ** |
0.005 |
肝指数（％） |
15.88±2.02 |
28.85±5.38 ** |
0.000 |
ALT |
31.17±6.78 |
75.00±32.21 ** |
0.000 |
AST |
106.33±22.99 |
223.91±153.74 * |
0.016 |
ALP |
70.42±8.73 |
107.55±24.11 ** |
0.000 |
γ -GT |
3.33±0.49 |
3.36±0.67 |
0.903 |
TP |
58.04±3.99 |
63.11±3.06 ** |
0.003 |
TG |
0.66±0.33 |
0.47±0.10 |
0.075 |
TC |
1.49±0.41 |
2.36±0.56 ** |
0.000 |
HDL |
0.83±0.19 |
0.62±0.09 ** |
0.004 |
LDL |
0.27±0.06 |
1.30±0.48 ** |
0.000 |
** 表示 高脂饮食组 与正常对照比较， P ＜ 0.01 ； * 表示 高脂饮食组 与正常对照比较， P ＜ 0.05 ；
表 2 实验 12 周 正常对照组和高脂饮食组病理组织学比较
| 例数 | 脂肪变 | 炎症 | 纤维化 | |||||
| F3 | F4 | G1 | G2 | S0 | S1 | S2 | ||
| 正常组 | 12 | 0 | 0 | 0 | 0 | 12 | 0 | 0 |
| 高脂饮食组 | 9 | 1 | 8 | 6 | 3 | 7 | 2 | 0 |
二、实验结束后正常对照组和模型 A 组生化指标及病理组织学比较
（一）实验结束后，正常对照组、模型 A 组大鼠肝指数和血清生化指标检测结果见表 3 ，结果显示模型 A 组大鼠的肝指数、 ALT 、 AST 、 ALP 、 TP 、 TC 和 LDL 均较正常对照组明显增高 ( P ＜ 0.05 或 P ＜ 0.01) ，其余指标无统计学差异。
表 3 实验结束后正常对照组和模型 A 组生化指标的比较
正常对照组 |
模型 A 组 |
|
例数 |
12 |
8 |
肝指数（％） |
2.66 ± 0.17 |
5.09 ± 0.78 ** |
ALT |
31.82±7.12 |
94.38 ± 37.89 ** |
AST |
125.73±20.48 |
338.13 ± 125.83 ** |
ALP |
75.55±21.58 |
140.63 ± 49.69 ** |
γ -GT |
2.0±1.26 |
2.75 ± 1.04 |
TP |
62.30±2.22 |
74.15 ± 5.00 ** |
TG |
0.91±0.39 |
1.00 ±0.26 |
TC |
1.83±0.29 |
3.63 ±0.43 ** |
HDL |
1.21±0.17 |
1.06 ±0.24 |
LDL |
0.24±0.07 |
1.72±0.47 ** |
SOD |
179.08 ± 12.12 |
174.63 ± 9.64 |
MDA |
6.38 ±0.71 |
4.71 ±0.62 |
** 表示 模型 A 组 与正常对照比较， P ＜ 0.01 ； * 表示 模型 A 组 与正常对照比较， P ＜ 0.05 ；
（二）实验结束后正常对照组 和模型 A 组病理组织学比较见表 4 ，两组比较采用两样本秩和检验。结果显示，肝脏组织的炎症程度在正常对照组平均秩和 6.71 ，模型 A 组平均秩和 16.72 ， Z=-4.022 ， P=0.000, 确切 P= 0.000 ＜ 0.05 ，有显著统计学差异；肝脏组织的纤维化分期在正常对照组平均秩和 6.50 ，模型 A 组平均秩和 17.00 ， Z=-4. 403 ， P=0.000, 确切 P=0. 000 ＜ 0.05 ，有显著统计学差异；肝脏组织的脂肪变程度在正常对照组平均秩和 6.50 ，模型 A 组平均秩和 17.00 ， Z=-4.347 ， P=0.000 ，确切 P=0.000 ＜ 0.05 ，有显著统计学差异。
表 4 实验结束后正常对照 组和模型 A 组病理组织学比较
例数 |
脂肪变 |
炎症 |
纤维化 |
||||||||||
F0 |
F1 |
F2 |
F3 |
F4 |
G0 |
G1 |
G2 |
G3 |
S0 |
S1 |
S2 |
||
正常对照 |
12 |
11 |
1 |
0 |
0 |
0 |
11 |
1 |
0 |
0 |
12 |
0 |
0 |
模型 A 组 |
9 |
0 |
0 |
0 |
0 |
9 |
0 |
5 |
4 |
0 |
0 |
8 |
1 |
注：正常对照组、模型 A 组和近红外光照射治疗组的肝脏组织病理学变化
正常对照组 模型 A 组 近红外光照射治疗组
1 F 0 G 0 S0 1 F 4 G 1 S1 1 F 3 G 0 S0
2 F 0 G 0 S0 2 F 4 G 1 S1 2 F 4 G 1 S0
3 F 0 G 0 S0 3 F 4 G 2 S2 3 F 4 G 1 S0
4 F 0 G 0 S0 4 F 4 G 1 S1 4 F 3 G 0 S0
5 F 0 G 0 S0 5 F 4 G 1 S1 5 F 4 G 2 S1
6 F 0 G 0 S0 6 F 4 G 2 S1 6 F 4 G 2 S1
7 F 0 G 0 S0 7 F 4 G 2 S1 7 F 3 G 0 S0
8 F 0 G 0 S0 8 F 4 G 1 S1 8 F 4 G 1 S0
9 F 0 G 0 S0 9 F 4 G 2 S1
10 F 1 G 1 S0
11 F 0 G 0 S0
12 F 0 G 0 S0
三、近红外光组与模型 A 组的生化指标和组织病理学比较
（一）近红外光组与模型 A 组的肝指数和血清生化指标见表 5 。结果显示，近红外光组 AST 和 MDA 较模型 A 组降低（ P ＜ 0.05) ，肝指数、 ALT 、 TG 、 TC 等也均有所下降，但统计学未见显著差异。
表 5 近红外光组 与模型 A 组的生化指标比较
模型 A 组 |
近红外光组 |
|
例数 |
8 |
8 |
肝指数 (%) |
5.09 ± 0.78 |
4.39 ± 0.77 |
ALT |
94.38 ± 37.89 |
69.88±31.95 |
AST |
338.13 ± 125.83 |
205.50±87.04 * |
ALP |
140.63 ± 49.69 |
133±43.06 |
γ-GT |
2.75 ± 1.04 |
2.5±1.51 |
TP |
74.15 ± 5.00 |
67.14±7.19 |
TG |
1.00 ±0.26 |
0.84±0.22 |
TC |
3.63 ±0.43 |
3.45±0.83 |
HDL |
1.06 ±0.24 |
0.77±0.19 |
LDL |
1.72±0.47 |
2.17±0.58 |
SOD |
174.63 ± 9.64 |
162.51 ± 9.08 |
MDA |
4.71 ±0.62 |
4.06 ±0 .58 * |
* 表示近红外光组与模型 A 组比较 ， P ＜ 0.05
（二）近红外光组和模型 A 组组织病理学比较结果见表 6 ，采用两样本秩和检验。结果显示：肝脏组织的炎症程度在近红外光组平均秩和 7.19 ，模型 A 组平均秩和 10.61 ， Z=-1.514 ， P=0.130 ，确切 P=0.167 >0.05 ，未见显著性差异；肝脏组织的纤维化程度在近红外光组平均秩和 5.50 ，模型 A 组平均秩和 12.11 ， Z=-3.101 ， P=0.002 ，确切 P=0.006<0.05 ，统计学有显著差异；肝脏组织的脂肪变程度在近红外光组平均秩和 7.31 ，模型 A 组平均秩和 10.05 ， Z=-1.964 ， P=0.050 ，确切 P=0.200 >0.05 ，未见显著性差异。
表 6 近红外光组 与模型 A 组的病理组织学比较
例数 |
脂肪变 |
炎症 |
纤维化 |
||||||||
F2 |
F3 |
F4 |
G0 |
G1 |
G2 |
G3 |
S0 |
S1 |
S2 |
||
模型 A 组 |
9 |
0 |
0 |
9 |
0 |
5 |
4 |
0 |
0 |
8 |
1 |
照光组 |
8 |
0 |
3 |
5 |
3 |
3 |
2 |
0 |
6 |
2 |
0 |
a b
c d
a ：红外线照射组，肝细胞脂肪变为 F4 ，肝细胞炎症为 G1 ； HE 染色× 100
b ：红外线照射组，肝纤维化 F0 期； Masson 染色× 100
c ：模型 A 组，肝细胞脂肪变为 F4 ，肝细胞炎症为 G2 ； HE 染色× 100
d ：模型 A 组，肝纤维化 F2 期。 Masson 染色× 100
结 论
本实验结果显示，近红外光照射 对大鼠高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病动物模型的 AST 、 MDA 和肝脏组织学变化（主要是肝纤维化程度）有改善作用，对大鼠高脂饮食非酒精性脂肪性肝病有一定的治疗作用。